Загальна в¦русолог¦я

No Comments



1.Основні етапи розвитку мікробіології, вірусології та імунології . внесок вітчизняних вчених

1. Емпіричних знань (до винаходу мікроскопів і їх застосування для вивчення мікросвіту).

Дж.Фракасторо (1546г.) припустив живу природу агентів інфекційних захворювань-contagium vivum.

2. Морфологічний період зайняв близько двохсот років.

Антоні ван Левенгук в 1675г. вперше описав найпростіших, в 1683г .- основні форми бактерій. Недосконалість приладів (максимальне збільшення мікроскопів X300) і методів вивчення мікросвіту не сприяло швидкому накопиченню наукових знань про мікроорганізми.

3. Фізіологічний період (з 1875р.) — Епоха Л. Пастера і Р. Коха.

Л. Пастер — вивчення мікробіологічних основ процесів бродіння і гниття, розвиток промислової мікробіології, з’ясування ролі мікроорганізмів в кругообігу речовин у природі, відкриття анаеробних мікроорганізмів, розробка принципів асептики, методів стерилізації, ослаблення (аттенуаціі) вірулентності та отримання вакцин (вакцинних штамів).

Р. Кох — метод виділення чистих культур на твердих поживних середовищах, способи фарбування бактерій аніліновими барвниками, відкриття збудників сибірської виразки, холери (коми Коха), туберкульозу (палички Коха), вдосконалення техніки мікроскопії. Експериментальне обгрунтування критеріїв Хенлі, відомі як постулати (тріада) Хенлі-Коха.

4. Імунологічний період.

І.І. Мечников — «поет мікробіології» за образним визначенням Еміля Ру. Він створив нову епоху в мікробіології — вчення про несприйнятливості (імунітет), розробивши теорію фагоцитозу і обгрунтувавши клітинну теорію імунітету.

Одночасно накопичувалися дані про вироблення в організмі антитіл проти бактерій та їх токсинів, що дозволили П. Ерліху розробити гуморальну теорію імунітету. У наступній багаторічної і плідної дискусії між прихильниками фагоцитарної та гуморальної теорій були розкриті багато механізмів імунітету і народилася наука імунологія.

У подальшому було встановлено, що спадковий і набутий імунітет залежить від узгодженої діяльності п’яти основних систем: макрофагів, комплементу, Т-і В-лімфоцитів, інтерферонів, головної системи гістосумісності, які забезпечують різні форми імунної відповіді. І. І. Мечнікову та П. Ерліху в 1908р. була присуджена Нобелівська премія.

5. Наступним важливим етапом у розвитку мікробіології стало відкриття антибіотиків. У 1929р. А. Флемінг відкрив пеніцилін і почалася ера антибіотикотерапії, яка призвела до революційного прогресу медицини. Надалі з’ясувалося, що мікроби пристосовуються до антибіотиків, а вивчення механізмів лікарської стійкості призвело до відкриття другого-позахромосомних (плазмідної) геному бактерій.

6. Сучасний молекулярно-генетичний етап розвитку мікробіології, вірусології та імунології розпочався у другій половині 20 століття у зв’язку з досягненнями генетики та молекулярної біології, створенням електронного мікроскопа.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.канонічні та неканонічні віруси. Морфологія, ультраструктура та хімічний склад вірусів

Морфологія вірусів

Форма віріонів може бути різною: палочковидної (вірус тютюнової мозаїки), пулевидної (вірус сказу), сферичної (віруси поліомієліту, ВІЛ), у вигляді сперматозоїда (багато бактеріофаги).

Розміри вірусів визначають за допомогою електронної мікроскопії, методом ультрафільтрації через фільтри з відомим діаметром пір, методом ультрацентрифугування. Одним із самих дрібних вірусів є вірус поліомієліту (близько 20 нм), найбільш великим. Натуральної віспи (близько 350 нм).

Віруси мають унікальний геном, так як містять або ДНК, або РНК. Тому розрізняють ДНК- і РНК-віруси. Вони зазвичай гаплоїдний, тобто мають один набір генів. Геном вірусів представлений різними видами нуклеїнових кислот: двунитчатої, однонітчатимі, лінійними, кільцевими, фрагментованими. Серед РНК-вмісних вірусів розрізняють віруси з позитивним (плюс-нитка РНК) геномом. Плюс-нитка РНК цих вірусів виконує спадкову функцію та функцію інформаційної РНК (іРНК).

Є також РНК-віруси з негативним (мінус-нитка РНК) геномом. Мінус-нитка РНК цих вірусів виконує тільки спадкову функцію.

Геном вірусів здатна включатися до складу генетичного апарату клітини у вигляді провірусу, проявляючи себе генетичним паразитом клітини. Нуклеїнові кислоти деяких вірусів (віруси герпесу та ін) можуть знаходитися в цитоплазмі інфікованих клітин, нагадуючи плазміди.

Розрізняють просто влаштовані (наприклад, вірус поліомієліту) і складно влаштовані (наприклад, віруси грипу, кору) віруси. У просто влаштованих вірусів нуклеїнова кислота пов’язана з білковою оболонкою, званої капсидом (від лат. Capsa. J футляр). Капсид складається з повторюваних морфологічних субодиниць. капсомеров. Нуклеїнова кислота і капсид, взаємодіючи один з одним, утворюють нуклеокапсид. У складно влаштованих вірусів капсид оточений додаткової ліпопротеїдної оболонкою суперкапсид (похідне мембранних структур клітини-господаря). Для віріонів характер спіральний, кубічний і складний тип симетрії капсиду. Спіральний тип симетрії обумовлений гвинтоподібних структурою нуклеокапсида, кубічний тип симетрії освітою изометрически порожнього тіла з капсида, що містить вірусну нуклеїнових кислот.

Капсид і суперкапсид захищають віріони від впливу навколишнього середовища, зумовлюють виборче взаємодія (адсорбцію) з клітинами, визначають антигенні та імуногенні властивості віріонів. Внутрішні структури вірусів називаються серцевиною.

Крім звичайних вірусів, відомі і так звані неканонічні віруси пріони.

Білкові інфекційні частки, що є агентами білкової природи, що мають вигляд фібрил розміром 10.20×100.200 нм. Пріони, мабуть, є одночасно індукторами і продуктами автономного гена людини або тварини і викликають у них енцефалопатії в умовах повільної вірусної інфекції (хвороби Крейтц-фельдта. Якоба, куру та ін.)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. класифікація вірусів. Основні принципи. Сучасні погляди на природу вірусів

Класифікація:

1.Віруси класифікуються на ті, що містять ДНК (вірус простого герпесу) і ті, що містять РНК (вірус імунодефіциту людини).

2.За структурою капсомерів. Ізометричні (кубічні), спіральні, змішані.

3.За наявністю або відсутністю додаткової ліпопротеїдної оболонки

4.За клітинами-хазяїнами

Найбільш вживана в теперішній час класифікація вірусів запропонована лауреатом Нобелівської премії Девідом Балтимором. Вона побудована на типі нуклеїнової кислоти, що використовується вірусом для переносу спадкового матеріалу, та на тому, яким шляхом відбувається її експресія та реплікація. Варто зазначити, що така класифікація не віддзеркалює філогенетичні зв’язки між видами вірусів, тому що віруси, згідно з загальноприйнятим зараз поглядом, мають механізми походження, відмінні від усіх інших організмів.

На відміну від клітинних організмів, генетична інформація яких зберігається у вигляді дволанцюгової ДНК, геном віруса може зберігатись як у вигляді дво-, так одноланцюгової нуклеїнової кислоти. При цьому цією кислотою може бути як ДНК, так і РНК, матрична форма якої (м-РНК) використовується в клітинах як проміжний продукт при трансляції генетичної інформації в процесі синтезу протеїнів. РНК-геноми вірусів можуть бути закодовані в двох протилежних напрямках: або гени розташовані в напрямку від 5′-кінця молекули до 3′-кінця (позитивний напрямок, або +полярність), аналогічно напрямку розташування генів в м-РНК в клітинах, або гени вірусного геному розташовані в протилежному напрямку (негативний напрямок, або -полярність).

Загалом на теперішній час описано близько 80 родин, в які входять приблизно 4000 окремих видів вірусів.

Розподіл родин на ряди розпочався нещодавно і відбувається повільно; на теперішній час виділено та описано діагностичні ознаки тільки трьох рядів, і більшість описаних родин є некласифікованими.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4.Механізм взаємодії віруса з чутливою кл.Вірогенія

1)Продуктивний тип-утворення повноцінних дочірніх інфекц.віріонів. Існує між вірусами і малочутливими кл., популяція дочірніх вібріонів часто буває дефектною.

2)Абортивний-при проникненні вірусів у нечутливі кл, або кл., які не спроможні забезпечити повний репродуктивний цикл вірусів. При цьому утворення інфекційних вірусних нащадків не відбувається або вони утв.в меншій кількості,ніж при продуктивному типі. Розвивається при зараженні чутливих кл. дефектними вірусами, позбавленими частини генома.Репродукція вірусів пригнічується інтерферонами.

Вірогенія-процес інтеграції вірусного генома в ДНК хазяїна.Такий геном називається про вірусом.Інтегрувати може повний вірусний геном або його частина,це більш властиво вірусам з кільцевою конфігурацією ДНК.У інтегрованому стані вірусний геном реп лікується одночасно з клітинною ДНК.При віро генії репродукція дочірніх вібріонів не відбувається,а клітина довго не може нормально функціонувати.При поділі клітини генетичні копії про вірусу передаються дочірнім кл.Інтеграція може призвести до утв.пухлин

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5. Особливості вірусних інфекцій. Роль вірусної НК та білка в інфекційному процесі

Відмінності патогенезу вірусних і бактер.інф:1)віруси використовують для розмноження транскрипційну і трансляційну системи кл.-хазяїна 2)віруси вбудовують свій геном в геном кл.-хазяїна 3) віруси можуть викликати мутації в ДНК кл.-хазяїна 4)Віруси можуть блокувати метаболізм кл., переключаючи його для синтезу вірусних НК і білків 5)в патогенезі вірусних інф.беруть участь противірусні системи макроорганізму: інтерферонова система,система антигеннеспециф.натуральних кілерів і антиген специфічних Т-лімфоцитів-кілерів 6)можуть викликати пухлинну-трансформацію

Геном може бути поданим тільки одним видом НК – ДНК або РНК. НК можуть бути одно-, двонитковими, лінійними, кільцевими, безперервними, фрагментованими. Двониткова ДНК може додатково скручуватись і утворювати компактну третинну структуру. РНК і ДНК можуть бути запаковані у віріоні по спіралі (утв. ниткоподібні і паличкоподібні віріони) і ізометрично (утв. сферичних віріонів). При запакуванні в капсиді НК можуть накручуватись на білкові стр-ри, або скріплені молекулами білків, такі комплекси є нуклеопротеїдом. Нуклеокапсид- комплекс НК і капсиду.

Білки: 1)Структурні –в складі суперкапсиду,капсиду і генома.Групи:

   суперкапсидні – є мембранними білками складних вірусів, вони пронизують ліпідний бішар наскрізь,або частково в нього занурені

   капсидні-складають структурні компоненти капсомерів.Захищає геном від навколишнього середовища

   геномні-пов’язані з вірусною НК. Утв. Рибо- і дезоксирибонуклеопротеїд. Мають певні антигенні властивості

2)Функціональні-це ферменти вірусів.

-клітинні-залучаються до складу віріонів при проходженні через мембрану(АТФаза)

-вірусні-містяться у віріонах у нативній або генетично закодованій формі:

*віріонні-локалізовані всередині віріону або на його поверхні(нейрамінідаза, лізоцим)

*вірус індуковані-інформація про них закодована у геномі, а самі ферменти утв.внаслідок його транскрипціїі трансляції (ДНК-,РНК-полімераза)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6. Антигенна структура.

Патогенність вірусівце їх потенційна спроможність викликати інфекційний процес. Фенотипічним проявом патогенності вірусів є вірулентність (інфекційність)- спроможність прикріплюватись, проникати і розмножуватись в чутливій клітині.

Факторами патогенності вірусів є : адгезіни , нуклеїнові кислоти, білки і ферменти.

Адгезінице протеїнові, глікопротеїнові або гліколіпопротеїнові структури, розташовані на вірусному суперкапсиді або капсиді і виконуючі функції рецепторів. За доп. адгезінів віріони прикріплюються до чутливих клітин, які мають гомологічний вірусному рецептору клітинний антирецептор. Клітина, яка не має антирецепторів до адгезінів даного віруса, ним не інфікується, це лежить в основі видового імунітету.

Нуклеїнові кислотиосновний фактор патогенності вірусів. Вірусні РНК і ДНК інфекційнімають спроможність проникати в клітини і забезпечувати репродукцію вірусів. Вірусні нуклеїнові кислоти, при інтеграції в ДНК клітини-хазяїна спроможні викликати або мутації, які ведуть до пухлинної трансформації клітин, або персистенцію вірусів.

Вірусні білки можуть викликати інтоксикацію організму як безпосередньо, так і за рахунок стимуляції гіперпродукції макрофагами інтерлейкіну-1В (ендогенного пірогену) і фактора некрозу пухлин-А (кахектину). Білки багатьох вірусів спроможні індукувати клітинний апоптозпрограмовану загибель клітини. Білки деяких вірусів мають канцерогенну, мутагенну та імуносупресивну дію.

Ферменти вірусів берут участь у проникненні в клітину і «роздяганні» віріонів ( нейрамінідаза, протеази), інтеграції вірусного генома у геном клітини-хазяїна; спроможні індукувати апоптоз клітин шляхом розщеплення клітинного рецептора bcl-2. Також вони здатні модифікувати клітинні гени росту і проліферації , що веде до їх активації і розвитку пухлинної трансформації клітини.

Вірусні ферменти мають антигістонову активність: вони інактивують білки-гістони, які беруть участь у структурно-функціональній організації хроматину клітини і є регуляторами імунітету.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7. Бактеріофаги- віруси , які мають властивість проникати в клітини бактерій, репродукуватися в них і звичайно спричинювати їх лізис.

Фаги складаються з нуклеїнової кислоти, оточеної білковою оболонкою- капсидом з точно орієнтованими капсомерами. Для крупних фагів характерна пуголовкоподібна або сперматозоїдна будова. Наявність головки, комірця і хвостового відростка, що закінчується шестикутною базальною пластинкою , до якої прикріплені фібрили. Хвостовий відросток фага має циліндричний стержень , оточений скоротливим чохлом.

Головка фагів має дві оболонки- зовнішню стінку і тонку внутрішню мембрану, у якій міститься нуклеїнова кислота.

Бактеріофаги Розрізняють:

   За вірулентністю

— вірулентні (спричиняють лізис клітини).

Феномен бактеріофагії, що спричинюється вірулентними фагами , проявляється послідовно у вигляді основних фаз: адсорбції, проникнення в клітину, репродукції і виділення фагів.

Адсорбція фага на поверхні бактеріальної клітини є результатом взаємодії аміногрупи білків, локалізованих у периферичній частині хвоста фага , і негативно заряджених карбоксильних груп на поверхні клітини бактерій. Розрізняють оборотну і необоротну фази адсорбції. Оборотна характеризується тим , що фіксовані частинки фага можна відокремити від клітини енергійним помішуванням. Після фази оборотної адсорбції наступає необоротна. Коли фаг не відокремлюється від тіла бактерії. Завдяки наявності ферменту типу лізоциму фаг утворює отвір у стінці клітини і проникає в тіло бактерії.

У хвостовому відростку фага є скоротливий механізм, за доп. Якого ДНК ін*єктується у пара плазматичний простір між клітинною стінкою бактерій і цитоплазматичною мембраною.

Після проникнення ДНК фага в бактеріальну клітину у ній відбувається синтез «ранніх» ферментів, які забезпечують низку складних реакцій, необхідних для біосинтезу фагової ДНК. У клітині з*являється інформаційна РНК, яка є комплементарною фаговій ДНК. Утворення « ранніх» ферментів змінюється синтезом білка вірусу на рибосомах і полісомах бактерій; потім фагові частинки спонтанно складаються, клітина руйнується, і фаги виділяються у зовнішнє середовище.

— помірні (інтегрують ДНК в геном, співіснують з клітиною в формі профага)

   За спектром дії: полівалентні (інфікують бактерії одного роду),моновалентні (інфікують бактерії одного виду),типоспецифічні (інфікують бактерії певного варіанту одного виду).

Морфологічні групи бактеріофагів: Ниткоподібні фаги,Голівчасті з рудиментарним відростком, Голівчасті з коротким відростком,

,Голівчасті з нескорочувальним відростком,Голівчасті з скорочувальним відростком і базальною пластинкою.

Моновалентні вірулентні фаги використовують для: Фаготипування епідемічних штамів збудників, Лікування і профілактики інфекцій, видової ідентифікації в діагностиці інфекцій.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

8.Віруси бактерій(фаги).Заг.характ.Феномен лізогенії.Фаг конверсія.Вик. помір.бакт.

Бактеріофаги – віруси, які мають властивість проникати в клітини бактерій, репродукуватися в них і звичайно спричинити їх лізис. За формою ага поділяються на чотири групи-які мають кубічну головку і відросток,кубічні,ниткоподібні,плеоморфні.

Структура Більшість бактеріофагів мають форму сперматозоїда .Вони складаються з гексанальної головки,в якій міститься ДНК,хвостового відростка(стержня оточеного білковим чохлом),базальної пластинки з фібрилами. Головка має двошарову оболонку утворену капсомерами ,які оточують одну щільно скручену молекулу ДНК. Порожнистий відросток служить для прикріплення до поверхні бактеріальної клітини та її інфікування. Адсорбується аг на клітині за допомогою базальної пластинки та фібрил-рецепторів.

Хімічний склад представлений нуклеїновою кислотою,білками,невеликою кількістю ліпідів в оболонці. В дистальній частині відростка під чохлом,міститься фермент лізоцим.

Резистентність фаги витримують високий тиск, зберігають активність при дії іонізуючого та рентгенівського випромінювання, а також при значеннях pH-2.5-8.5.Однак вони швидко втрачають свої властивості при кип’ятінні,дії дезінфікуючих розчинів та ультрафіолетових променів.

За спектром дії полівалентні (інфікують бактерії одного роду), моновалентні (інфікують бактерії одного виду), типоспецифічні (інфікують бактерії певного варіанту одного виду).

За вірулентністю вірулентні (спричиняють лізис клітини), помірні (інтегрують ДНК в геном, співіснують з клітиною в формі профага).

Етапи репродукції бактеріофагів — Адсорбція, Проникнення (ін‘єктування нуклеїнової кислоти), Репродукція, Зборка вірусних фагових частинок у цитоплазмі бактерій, Вихід фагових частинок із клітини після її лізису.

Коли з клітиною взаємодіють помірні бактеріофаги,частина клітин залишається неушкодженою ними,тому що спостерігається явище лізогенії-інтеграції генома бактеріофага в геном клітини. Такий фаг ,який вмонтований в хромосому клітини,називається профагом. Лізогенізація має велике біологічне значення, тому що під впливом бактеріофагів можуть суттєво змінюватись біологічні властивості бактерій. Так,наприклад, нетоксигенні штами коринобактерій дифтерії в результаті лізогенізації перетворюються у токсигенні .Зміни властивостей бактерій під впливом профага дістала назву фагової конверсії. Можливо, завдяки їй більш інтенсивно утворюються нові біовари і сировари бактерій,особливо серед родин Enterobacteriaceae i Vibrionaceae.

Помірні фаги широко використовуються як модель для вивчення питань генетики,за допомогою якої можна точніше диференціювати процеси мінливості і спадковості.Їх застосовують у генній інженерії як вектори для передачі для передачі генів еукаріотів прокаріотам і створення штамів продуцентів біологічно активних речовин,що використовуються в біотехнології(інтерферон,інсулін,інтерлейкіни).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

9.Культивування вірусів.Основ.методи

Віруси культивують основними 3 методами – В організмі чутливих лабораторних тварин, В 10-денних курячих ембріонах, В культурах клітин.

Культивування вірусів необхідне для подальшого їх дослідження з метою ідентифікації,дуже важливо провести правильний забір, швидке транспортування матеріалу до лабораторії,раціональний вибір тест-систем(курячі ембріони,культури клітин,лабораторні тварини).

Зараження курячих ембріонів Існують 2 способи зараження курячих ембріонів — відкритий і закритий. При відкритому способі шкаралупу над мішком обробляють спиртом і розчином йоду,за допомогою гострих ножиць зрізають шкаралупу, знімають верхній листок оболонки повітряного мішка і проводять зараження. Отвір закривають скляною кришкою і герметизують стерильним розтопленим парафіном.

При відкритому способі роблять отвір у шкаралупі і вводять за допомогою шприца 0.1-0.2 мл вірус місткого матеріалу під контролем овоскопа. Отвір заливають парафіном, а ембріон закладають у термостат.

Для виділення вірусів їх можна заражати на хоріоналантоїсну оболонку, в алантоїсну порожнину, жовтковий мішок.Заражені ембріони інкубують у термостаті протягом 2-4 діб.Потім їх охолоджують до температури 4˚С протягом 1 доби для максимал. звуження судин. Розтинають ембріон, матеріал із порожнини відсмоктують стерильним шприцом.Після виймання поміщують у срильні чашки Петрі.

Зараження лабораторних тварин Найчастіше використовують білих мишей,білих щурів, гвінейських свинок, кролів,ховрахів,бавовникових щурів,мавп. Досліджуваний матеріал можна вводити через рот, удихальні шляхи, надшкірно, внутрішньошкірно,підшкірно,внутрішньомязово,внутрішньочеревно,у передню камеру ока, у мозок…Перед зараженням матеріал обробляють антибіотиками для деконтамінації від бактерій.Після зараження за тваринами спостерігають до появи клінічних ознак захворювання(2-4 тижні). Їх забивають, дотримуючись правил роботи з інфікованими тваринами, а органи досліджують на наявність вірусів.

В культурах клітин Тепер у будь-якій вірусологічній лабораторії є спеціальні лінії культур клітин які високочутливі до більшості вірусів. До них належать перещеплювані культури клітин HeLa(карцинома шийки матки),Hep-2(карцинома гортані людини), Vero(нирки зеленої мавпи),KB(карцинома ротової порожнини людини), первинно-трипсинізовані культури ембріонів людини, нирок мавп, фібробластів ембріона курки. Культури клітин-первинні (отримують шляхом трипсинізації шматочків тканин органів, дають 10 поколінь),напівперещеплювані (отримують з диплоїдних клітин, дають до 100 поколінь),перещеплювані (отримують з пухлинних клітин, дають необмежену кількість поколінь.Для підтримання росту культур клітин використовують середовище 199(культивування первинно-трипсинізованих і перещеплюваних культур клітин),серед. Ігла (містить мінімальний набір амінокислот і вітамінів).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

10.Вкористання клітинних культур у вірусології. Класифікація культур клітин. Поживні середовища для культивування культур клітин.

Культури клітин – це популяція однотипних клітин організму людини чи тварини, яка вирощується в штучних умовах і призначається для культивування вірусів. За тривалістю життя клітинні культури поділяються на : 1)первинні,2)напівперещеплювані,3)перещеплювані.

Вирощують культури клітин в стерильних умовах у спеціальному плоскому скляному посуді, в який додають живильні середовища, які містять фізіологічну кількість амінокислот, вуглеводів, мінеральних солей, рН=7.2-7.4.Також є індикатор, який змінює колір при зсуві р зсуві рН від оптимального .Найчастіше використовується середовище 199(яке включає 60 компонентів і застосовується для перещеплюваних і первинно трипсинізованих клітин) і Ігла(містить мінімальний набір амінокислот і вітамінів,використовують для культивування диплоїдних і перещеплюваних клітинних культур).Для забезпечення асептичних умов в живильні середовища додають антибіотики.

Первинні – одержують з тканин тварин і людини шляхом їх ферментативної дезінтеграції. Шматочки тканини поміщають у 0,25% роз-н трипсину при температурі 37С і періодично перемішують. У результаті цього відбувається відділення клітин тканини одна від одної. Порції клітин збирають у міру відділення, центрифугують, трипсин зливають, вносять середовища росту і суспендують в ньому клітини. Первинні культури клітин можуть проходити до 10 поділів in vitro, мають високу чутливість до багатьох вірусів, можуть бути отриманні у великій кількості, безпечні в онкогенному відношенні. Недоліком первинних культур є значна праце місткість і тривалість одержання, а також можлива контамінація латентних вірусів. До первинних культур клітин належать клітини нирки ембріона людини, макаки резус, ембріона свині, фібробласти курячих ембріонів.

Напівперещеплювані – є диплоїдними клітинами одного типу, які спроможні здійснювати in vitro до 100 поділів, зберігаючи при цьому вихідний диплоїдний набір хромосом. До напівперещеплюваних належать фібробласти ембріона людини. Ці клітини надзвичайно вимогливі до умов культивування, тому в практиці вірусологічних лабораторій мають обмежене застосування.

Перещеплювані культури клітин – це однотипні пухлинні або нормальні клітини людини і тварини зі зміненим стереотипом, що необмежено ростуть in vitro.До них відносяться клітини HeLa –клітин карциноми шийки матки,клітини карциноми порожнини рота людини – КВ, Vero –клітини нирки зеленої мавпи, СПЕВ (клітини нирки ембріона свині),клітини карциноми гортані людини.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

11.Індикація вірусів: р-ія гемаглютинації, р-ія гемадсорбції, цитопатична дія(ЦПД), її виявлення.

Індикація вірусів – це виявлення їх в досліджуваному матеріалі без встановлення їх родинної, родової, видової приналежності чи сероваріанту.

Р-ція гемаглютинації ґрунтується на спроможності деяких вірусів, що міст гемаглютиніни на зовнішній оболонці, склеювати еритроцити людини чи певних видів тварин. Для проведення РГА використовують вірусовмісну рідину, яку змішують з 0.5 мл ізотонічного розчину і 0.5 мл 1%суспензії відмитих еритроцитів. Інкубують при37(20 або 4С в залежності від властивостей вірусу).Якщо результат негативний – аглютинація не розвивається, отже в досліджуваній рідині вірусу немає. Якщо спостерігається аглютинація – результат позитивний, отже в досліджуваній рідині наявний вірус. Контролем є суміш з 0.5мл еритроцитів з 0.5 мл ізотонічного розчину натрій хлориду,який не містить вірусу.

Р-ія гемадсорбції – виявляє віруси, що містять гемаглютиніни, у клітинах до розвитку ЦПД. Гемадсорбція спостерігається, коли гемаглютиніни присутній на цитоплазматичній мембрані клітини. Р-ія Гадс проводиться шляхом внесення в клітинну культуру 0.2 мл 0.5% суспензії еритроцитів, клітини інкубують 15-20хв при37С(20С або 4С, в залежності від властивостей вірусу).Потім пробірки струшують для видалення не адсорбованих еритроцитів і враховують під малим збільшенням мікроскопа їх скупчення на окремих клітинах ч на цілому моношарі. Якщо клітини не інфіковані вірусом, адсорбції еритроцитів на їх поверхні не буде спостерігатись.

ЦПД –це морфологічні зміни в культурах органів і тканин, які виникають у процесі репродукції вірусів у клітинах. Віруси з ЦПД називають цитопатогенним. Характер ЦПД залежить від властивостей, дози вірусу, властивостей самої клітини і умов її культивування.

ЦПД може проявлятися:

— некрозом – більшість клітин руйнується, інші зморщуються(пікноз ядра і цитоплазматичної мембрани, вакуолізація), для них характерна подвійна променезаломлюваність – сильне світіння при мікроскопії.

-гроноутворенням – клітини округлюються, збільшуються, частково зливаються між собою з утворенням гроноподібних скупчень.

-симпласто- і синцистоутвореннямсинтицій складається з клітин, сполучених цитоплазматичними містками, симпласт – це велика багатоядерна клітина, яка утворилась в результаті багатоядерних незавершених мітозів

-круглоклітинною дегенерацією – округлення клітин і втрата ними міжклітинних зв’язків,, може також спостерігатися пікноз, зморщування і деструкція клітин.

— клітинною проліферацією

— осередковою деструкцією – на фоні збереженого в цілому моношару з’являються осередки ураження клітин(мікробляшки)

При відсутності або слабко вираженій ЦПД проводять зараження культурною рідиною нових культур клітин

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

12. Ідентифікація вірусів:РН,РГГА,РГГадс,виявлення включень.

РН– може бути проведена на культурі клітин, курячих ембріонах і тваринах. У пробірках готують нейтралізаційні суміші, які складаються з рівних обїємів вірусовмісного матеріалу і діагностичної симоватки (1,0 мл). Після ретельного струшування приготовлені суміші витримують 3 год при 37С. Потім нейтралізаційні сцуміші вносять у чутливу клітинну культуру, яку інкубують при 37 С 5-7 діб. Після цього, враховують результати за ЦПД і кольоровою пробою. Якщо АГ виділених вірусів відповідають АТ діагн. сироватки, то вір. інактив. і не викликають інфікування клітин культури (ЦПД відсутня). Живі незаражені вірусами клітини, виділяючи кислі метаболіти, виклик. зміну кольору середов. з малин. на жовтий. У цьому випадку РН вважається позитив, а виділені вір. ідентифік. по діагност. сироватці. При розвитку ЦПД і зберіганні червон. кольору в середов. культивування клітинної культури РН вваж. негативною, а виділені вір. – неідентифікованими.

РГГА – використовують для ідентификації вірусів, які мають поверхневий АГ- гем-аглютинин, спроможний викликати аглютинацію еритроцитів. Вірусні гемаглютинини видо- і типоспеціфічні. Механізм РГГА полярає в тому, что діагностивні АТ – антигемаглютинини перешкоджають вірусам аглютинувати еритроцити чутливих вірусів тварин. У пробірках в ізотоніч. розчині NaCl готують дворазові розведенна діагн. сироват. (1:10, 1:20). Потім у кожну прорбірку вносять рівну кількість вірусовмісної рідини, в якій знаходиться 4 ГАО вір. Суміш витримують при кімн. темп. 1 год., після чого в кожну пробірку вносять рівний обєм 1% суспензії еритр. Суміш інкубують 30-60 хв. при 22 С і врахов. результати реакції. РГГА вваж. позитив. , якщо ГГА наступає, а виділені віруси типуються діагн.сиров.Навпаки,якщо вір. гемаглютиніни не гомологічні АТ діагн.сиров, то вір. не втрачають спроможність склеювати еритр.У цьому випадку РГГА рахується негатив,а виділені вір-не ідентифікованими.

РГГадс- викор. для ідентифік. вір., які мають гемаглютинин. Для цього діагн. сиров. в розведенні 1:5 і к-сті 0,2 мл вносять у проб. з вірусінфіков. клітин. Культурою, витримують 30-60 хв. І добавляють 0,2 мл 0,5% суспензії еритр. Проб. інкубують 20-30 хв. при температурі, оптимальній для гемадсорбції вірусів, які виділяються. Якщо АГ вір. гомологічні АТ сироватки, то вір. втрачають спроможність адсорбувати еритр. На поверхні клітин культури. У цьому випадку РГГадс є позитивною, а виділені вір. ідентификують за діагн. сиров. Якщо вір. АГ не гомологічні, АТ діагн. сироватки еритр. адсорбуються на клітинах, отже РГГадс негатив, а вір не ідентифіковані.

Виявлення включень-виявляють при світловій імерсійній мікроскопії після фарбування моношару за Роман-Гімзою,або при люмінесцентній мікроскопії після обробки акридиновим жовтогарячим.При фарбуванні за Ром-Гім. Вірусні включення набувають рожевого або рожево-бузкового кольору.При фарбуванні акридіновим жовтогарячим ДНК-структури дають зелене світіння, а РНК-струк-червонясто-жовтогаряче.Зараз виявлення внутрішньоклітинних включень проводять при діагностиці сказу(тільця Бебеша-Негрі).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

13.Генетика вірусів.Мутації та генетичні взаємини у вірусів.

Особливості вірусних геномів,які відрізняють іх від геномів про і еукаріотів:

1)розмаїтість носіїв генет.інформації-віруси використ.як і ДНК , так і РНК.

2)монотипність вірусного генома-РНК або ДНК(одночасно дві нуклеїнові к-ти виключені)

3)гаплоїдність геномів,тобто кожний вірусний ген поданий тільки однієї копією.Виняток-ретро і реовіруси.

4)мала розмірність геномів-в 10 в 6 ступені разів менше геномів евкаріотів.І містять від 3-до 200 генів проти сотень тисяч у еукаріотів.

5)структурний поліморфізм геномів:можуть мати моноцистронну і поліцистронну структуру генома з мозаїчною(переривчастою) і непереривчастою організацією генів.

6)наявність механізмів збільшення інформативної ємності вірусного генома,що дозволяє вірусам містити значно більшу к-сть генів,що допускає молекулярна масам генома.До таких механізмів відноситься:перекривання генів,множинність рамок зчитування генет.інформ, зсув рамки трансляції,сплайсінг,транскрипція з областей ДНК,які перекриваються, нарізування поліпептида-попередника на діялнки різної довжини,сегментований геном.

Мутації-це зміни первинної структури генома,які успадковуються.Мутації виникають під впливом фізичних,хім і біологічних мутагенів і не зникають після усунення їх дії.

До фізичних сутагенів належить променева енергія,до хім-різні органічні азот і хлорвмісні з»єднання,до біол-порушення функц. вірусних ферментів- транскриптаз.Мутації,які виникли під дією хім і фіз є індукованими, ті що виникли при збої транскриптах-спонтанні. За фенотипом мутації підрозділяються:1)нейтральні(помітно не впливають на ж/д вірусів).2)умовно-летальні(викликають загибель вірусів за певних умов)3)летальні-викликають загибель вір. у наслідок повної втрати спроможності репродуктуватися.

Мутації можуть бути прямими(змінюють фенотип) і оберненими(відновлюють вихідний фенотип). За к-стю генет.матеріалу:генні та геномні.Якщо генні і геномні мутації відбуваються в межах одного вірусного генома це внутрішньогеномні мутації.Якщо ці мутації відбув.між геномами двох вірусів або геномами вірусу і клітини хазяїна-їх наз генетичними рекомбінаціми.

Генні мут-це мут,що відбув. В межах одного гена.Можуть бути:крапкові,триплетні і політриплетні. Геномні мут-можуть бути подані делеціями,транслокаціями,інверсіями або дуплікаціями одного або декількох генів одного вірусного генома.

Генетичні рекомбінації-це обміни генетичним матеріалом,як між самими вірусами,так і між вірусами і клітинами-хазяїна.

Рекомбінації можуть здійснюватись одним з 4 способів:

1)шляхом кросінговера-характерна переважно для ДНК-вірусів.Дефектні геноми 2батьківських вір. перехрещуються,у місці перехресту нитки ДНК розриваються і з»єднуються з чужорідними фрагментами.У результаті рекомбінації в одного з рекомб.вір. нормальний геном цілком відновлюється.

2)шляхом транскрипції «у вигляді стрибка»-характерна для РНК-вірусів.При копіюванні »+»-ланцюга в «–«-ланцюг полвмераза може «перестрибувати» з одного + на інший,створюючи гібридну «-»-матрицю РНК,яка не містить генет.дефектів.

3)шляхом транслокації спостерігається у ДНК вірусів з сегментованим геномом.Суть процесу-обмін між родинними вірусами одним або двома сегментами РНК,які містять повнорозмірні гени.

4)шляхом інсерції з наступною делецією-характерні для ДНК і РНК вірусів спроможних інтегрувати свій геном у геном клітини хазяїна(ретро- герпес- адено-).

 

 


Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

64 + = 67